隨著各地都在建立PCR實驗室，本文從硬件基礎的角度，梳理了PCR實驗室建設的幾個關鍵點，獨立醫(yī)學實驗室可以運用豐富的運營經驗，進行建設指導、人員梯隊建立、質控體系搭建、區(qū)域化服務支持等。

如何建設PCR實驗室

與PCR實驗室建設相關的指導文件主要有四份：

《醫(yī)療機構管理條例》

《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》

《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》

《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》

要求臨床PCR實驗室，不但在實驗室設置及儀器設備等硬件上要滿足開展臨床檢驗的條件，而且要求實驗室在日常工作要有文件化的工作程序。

下面就在PCR實驗室建設過程中的幾個關鍵控制點進行闡述:

01

建立PCR實驗室質量管理體系

根據(jù)實驗室的具體情況編寫質量體系文件，《質量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導書》，并保證管理體系運行有效。

管理體系的特點是應有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效的機制、能自我發(fā)展的整體。

建立完善的SOP文件，對完成各項質量活動的方法作出規(guī)定，每個SOP都應對一個或一組相互關系的活動進行描述。

每個SOP文件應說明該項質量各環(huán)節(jié)的輸入、轉換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關活動的接口關系。

明確每個環(huán)節(jié)轉換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應的審批手續(xù)。

規(guī)定在質量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。

02

PCR實驗室的相關設置

要完成一組PCR實驗，通常需要經過試劑配制、樣品處理、核酸擴增和產物分析4個實驗過程。

這4個實驗過程的實驗用房應相鄰布置，組成一個獨立的PCR實驗區(qū)。標準的PCR實驗區(qū)包括:試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。

PCR實驗室整體平面布局

某醫(yī)院PCR實驗室平面布局如圖1所示，整個區(qū)域有一個公用走廊，每個獨立實驗區(qū)設有專門的緩沖區(qū)。通過壓差控制，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染，并且降低擴增產物對人員和環(huán)境的污染。

試劑準備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內，并在本區(qū)內制備成所需的貯存試劑。

試劑準備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內。

房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染。

標本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

標本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內。在標本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進行提取核酸的操作。

為避免提取的核酸在柜內反復循環(huán)，造成標本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實驗室，排風經過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實驗室中。

根據(jù)經驗，如果實驗室內配備生物安全柜，每配備一臺，實驗室的面積增加10m2;標本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。

擴增室

該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。

在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內進行。

擴增室主要配備PCR實驗室的核心儀器PCR儀，本文實例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。

在實驗室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。

本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。

產物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。

在室內配備通風櫥，保證房間內的相對負壓，空氣從室外流向室內。該區(qū)面積控制在15m²~20m²。

本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。

03

正負壓區(qū)域緩沖室的設置

根據(jù)壓力梯度的要求，試劑配制室和樣品處理室為相對正壓，擴增室和產物分析室為相對負壓，要求正壓的區(qū)域和要求負壓的區(qū)域的緩沖室內的壓力設計大不相同。

正壓緩沖室符合一般正壓潔凈室的緩沖原則，主要是防止室外環(huán)境空氣中的氣溶膠進入室內。

負壓緩沖室則是要求緩沖室對核酸擴增室及產物分析區(qū)保持正壓，對緩沖室外也保持正壓(主要是滿足室內凈化需要，如室內無潔凈要求，此處可以為0壓)。

04

污染的預防與控制

PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型:擴增產物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標本間的污染。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。

• 工作區(qū)域的嚴格劃分，各個實驗區(qū)域要有明顯的標記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等)，以避免各個不同實驗區(qū)域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。
• 合理的系統(tǒng)設置，合理的空調通風系統(tǒng)設置，盡量采用全送全排的空調系統(tǒng);嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內不同的壓力要求。
• 規(guī)范的操作，臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經常更換。清潔工作及時、正確。實驗工作結束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。
• 嚴格的管理:嚴格控制進出實驗室的人員。在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服(如不同顏色)，當工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域;盡量減少在實驗區(qū)內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。擴增產物分析區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等;

總之，實驗室建設是一個復雜的問題，這里不討論人員的問題，實驗室人員的培養(yǎng)與沉淀，也需要一個過程，在建設的過程中要因地制宜，不要生搬硬套，結合自己的實際慢慢摸索出適合自己發(fā)展的建設思路?？茖W合理建設實驗室，更好的發(fā)揮實驗室的作用。

參考資料：

[1] 中華人民共和國住房和城鄉(xiāng)建設部，中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB50591-2010，潔凈室施工及驗收規(guī)范[S].北京:光明日報出版社，2010.

[2] 許鐘麟.空氣潔凈技術原理(3版)[M].北京:科學出版社，2004.

[3] 《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號).

[4] 劉書慶，謝逢潔.質量管理體系建立與實施維護[J]工業(yè)工程，2003 .

[5] 2010年，衛(wèi)生部辦公廳關于印發(fā)《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》的通知 .